如何得到稳定表达的内参基因

最近遇到一客户咨询筛选内参基因的问题，想想当年小编也是遇到同样的问题，今天就手把手教您如何选择稳定的内参基因。

为什么要选择内参基因呢？荧光定量PCR因其高度的灵敏性和特异性而被广泛应用于基因表达量分析。在qPCR实验中采用稳定表达的内参基因，可增加实验结果的可靠性和稳定性。

何为内参基因

管家基因是维持细胞生命活动所必需的一类基因，在所有组织细胞中均有表达，长久以来一直被用作内参基因。然而，越来越多的证据显示，管家基因在不同组织或细胞中表达并不恒定，而且在不同实验处理中最适内参基因也有不同，因此选择合适的内参基因很重要。

如何选择合适的内参

常用的内参筛选软件有Genorm（version3.5）和Normfinder（version0.953），这两个软件都不能用原始Ct值数据，需按说明书进行数据转换后才能用软件进行计算。

Genorm数据转换采用delta-Ct公式进行数据转换。

公式：

Q = E deltaCt= E(minCt - sampleCt)

Q = sample quantity relative to sample with highest expression

E = amplification efficiency (2 = 100%)

minCt = lowest Ct value = Ct value of sample with highest expression

数据转换操作

新建Excel表格，行标题为基因名称，列标题为样本名称，每个基因中表达量最高的值被设置为1，将计算得到的各样本对应各基因的数值输入表格，将该文件保存成xls格式，关闭所有Excel程序，启动Genorm程序（如下图）；

导入转换好的数据，点击Calculate按钮，程序自动给出M值表格，红色表示表达最不稳定基因，绿色表示稳定表达基因；逐步去除表达最不稳定基因（红色），直至剩下两个最稳定内参基因。

再次点击图表上方柱形图按钮，将会给出配对变异Vn/n+1结果图，该图显示需要内参基因的数目，0.15为默认阈值，如V2/3＜0.15表明2个内参基因就够了，如大于0.15表明需要额外的内参基因进行计算，一般来说2个内参基因就够了。

Normfinder数据转换采用自然对数进行转换，行标题为样本名称，列标题为基因名称，数值为原始Ct值取自然对数。打开normfinder软件（如下图），用Selectinut data调用数据，勾选相关选项进行计算。打开normfider软件，点击Getting Started会有详细描述。

Genorm和Normfinder因算法不一致，得到的结果可能不一致，选择一个两个软件都显示比较稳定的内参基因即可。

注：如有需要此软件，可私信小编。